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非洲猪瘟（African swine fever，ASF）具有高传染性和致病性，给养猪业造成巨大经济损失。研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）基因分型有助于从分子水平追溯引发疫情的病毒来源，掌握潜在的传播途径及可能的传播方式。随着ASFV分型技术的不断演变，ASFV基因组遗传演变研究不断深入。截至目前，ASFV已被划分成24个基因型或8个血清群。本文综述了ASFV P72（B646L）基因分型、IGR分型、9RL/B602L基因分型、P54（E183L）基因分型等的研究历程，特别是最新的IGR分型研究。研究显示：P72基因相对保守，因此P72基因分型是国际最通用、快速、方便的分型方法，并且是新传入地域进行鉴别诊断的首选方法；其他基因分型及血清群分析，可有助于预判ASFV分子流行病学变化和毒力演变。本研究可为我国ASFV诊断技术及遗传演变研究提供参考。
非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）基因组为线状双链DNA，整个基因组长度为170~193 kb，包括左侧可变区（left variable regions，LVR）38~48 kb，中央保守区（central conserved region，C区）约125 kb和右侧可变区（rightvariableregion，RVR）13~22 kb。不同毒株的基因组序列可能会在LVR内的多基因家族（mltigene family，MGF）、C区内的中央可变区（central variable region，CVR）和EP402R基因（表达CD2v蛋白）等位置存在显著差异。这些可变区为ASFV的进化分析特别是遗传演变研究提供了有力条件。但是我国针对该领域还无专业阐述，没有全面展示ASFV基因分型和血清分群的研究进展，为此就相关研究进展进行综述，以期为我国ASFV诊断技术及遗传演变研究提供参考。
1 基因分型研究
在非洲猪瘟（African swine fever，ASF）早期研究中，科研工作者借助红细胞吸附试验（hemadsorption reaction）、琼脂扩散沉淀试验（agar diffusion precipitin test）、补体结合试验（complement-fixation test）和等电沉淀技术（isoelectric precipitation）等诸多技术，逐渐认识到ASFV存在抗原多样性。随后，利用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，将ASFV分为I、II、III和IV共4个主要群（1984年）或I—V共5个组（1989年），并提出以此方法进行病毒分型应以基因组的中间位置为目标区域。另有报道利用RFLP对软蜱中分离的ASFV进行了分型研究；但是RFLP技术无法快速进行病毒来源追溯，使得利用该技术进行ASFV分型的研究停滞不前。伴随着基因克隆技术、PCR技术和测序技术的快速发展，ASFV的基因组研究也在不断深入。继1984年首次成功构建含有98%基因组信息的文库之后，ASFV基因组文库构建的研究逐渐增多，这为后期的基因测序及分析打下了基础。
2 P72（B646L）基因分型
1990年，Lopez-Otin等对P72蛋白编码基因全长进行了测序分析，为研究P72蛋白编码基因作为诊断基因奠定了基础（P为结构蛋白英文缩写，72指蛋白相对分子质量103的数字部分）。1992年，Steiger等首次利用PCR技术建立了ASF快速诊断技术。1996年，Yu等对4株分离自不同地区的ASFV P72基因核酸及编码蛋白序列进行比对，发现P72基因序列高度一致（97.8%~100%），该结果与之前研究发表的P72蛋白抗原稳定的结论相符，由此进一步奠定了P72基因作为抗原分型理想基因的重要地位。
2001年，Gonzague等利用P72基因部分片段证明了1999年分离的ASFV马达加斯加毒株与1994年分离的莫桑比克毒株序列最接近。2003年，Bastos等利用P72蛋白C端末端（位置为498~635）序列，首次将ASFV划分为10个基因型。通过与RFLP方法比较，该研究证实在P72基因序列水平上，不同ASFV毒株之间的遗传变异率可达9.4%，说明该方法适宜进行分子流行病学分析且可以更好地区分暴发时间和地理分布相近的非洲东部或南部毒株。2005年，Lubisi等进一步将ASFV划分为16个基因型，并首次从东非境内的森林循环宿主（软蜱或野猪）中发现基因I型毒株。2007年，Boshoff等对南非1973—1999年分离的43株ASFV进行比对分析，发现了6个新分支。至此，ASFV被划分为22个基因型。
此后，ASFV的进化分析主要以此为基础，利用P72基因进行ASFV基因分型的研究逐渐增多并成为最重要的分型标准。2016年，Achenbach等对2011—2014年埃塞俄比亚分离的ASFV进行P72基因进化分析，发现了第23个基因型。该基因型与流行于非洲东部国家和刚果民主共和国的IX和X基因型来源于同一个进化分支。2017年，Quembo等在莫桑比克戈龙戈萨国家森林公园采集的软蜱样品中分离到19株ASFV，经进化树分析发现，其中5株病毒属于新的进化分支，因此被命名为第24个基因型。基于P72基因分型已被广泛使用，所以通常所说的ASFV基因型就是指P72基因分型。
3 IGR分型
虽然P72基因分型的方法得到大多数研究者认可，但这种分型对于家猪相关分支（如基因I型分支，又称ESACWA分支）内毒株相互之间的区分度太低，因此导致P72基因分型方法较少用于追踪同一区域内疫情暴发的源头和过程。为进一步查找同一地域内相近毒株的进化演变趋势，2014年Gallardo等对ASFV全基因序列进行了深度分析，发现不同地域/时间流行的ASFV在I73R和I329L基因的中间区域（intergenic region，IGR）存在不同数量组合的串联重复序列（tandem repeat sequences，TRS），如波兰和立陶宛ASFV分离株的IGR与白俄罗斯和乌克兰分离株相同（有10 bp的重复序列插入，后命名为IGR-II型），而与俄罗斯分离株不同（无10 bp的重复序列插入，后命名为IGR-I型），提示波兰和立陶宛ASFV流行株可能来自白俄罗斯。但进一步研究发现，俄罗斯境内的ASFV分离株从2012年开始在IGR位置出现变化，提示传入欧盟的ASFV毒株可能来源于俄罗斯。该毒株于2012年或更早的时期出现，经由白俄罗斯和乌克兰传入欧盟。2015年以后，在波兰检测到IGR-I型毒株，在俄罗斯西部检测到IGR-II型毒株，表明欧洲地区的病毒流行更加复杂，也说明IGR分型可以对ASFV的分子流行情况提供更精确的分析，并在很多研究中成为与P72基因分型和CD2v血清学分型同等重要的分析指标，如在中国、比利时、印度、韩国、马来西亚、印度尼西亚、越南、俄罗斯、意大利等首发/重要疫情确诊毒株或长时间流行毒株演变分析中，均使用IGR分型进行进化溯源分析。
2018年8月，ASFV传入我国后，我国科学家对引发每次疫情的分离株都进行IGR分型分析。目前国内主要的流行毒株属于IGR-II型。但2018年11月国内分离的第一个野猪疫情毒株（China/Jilin/2018/boar，MK189457）属于IGR-I型，与当时家猪流行毒株不同，因此推测此次疫情不是由周边家猪传入。2019年3月，国内首次发现IGR位置出现2个串联重复序列（20 bp）插入的毒株（China/Guangxi/2019/domestic pig，MK670729），这是世界范围内首次发现，并因此将其命名为IGR-III型毒株。相似的，IGR I—III型毒株在韩国和越南也有报道。较详细的数据显示，越南对2019—2021年分离的122株ASFV进行了IGR分型研究，发现IGR II型毒株占95.9%（117/122），IGR III型占3.3%（4/122），IGR I型只分离到1株。2019年，波兰发现了3个串联重复序列（30 bp）插入的毒株（Poland，Warminsko-Mazurskie 2019），并将其命名为IGR-IV型毒株。IGR分型的不断增加，预示着ASFV在长时间流行过程中，伴随着在猪体内的不断复制传播，可能会在某些位置（如IGR位置）出现序列变化。
4 9RL/B602L基因分型
1990年，Dixon等利用RFLP技术，对17株马拉维共和国分离株进行序列分析，发现在ASFV基因组中部125 kb的保守区域内含有1个CVR。1996年，Irusta等进一步对CVR研究发现，该可变区是因9RL基因中四聚体重复区存在序列差异导致的，且在不同毒株以及细胞适应株与种毒之间变异性较高。Irusta等发现CVR的片段大小为228~300 bp，Phologane等发现CVR片段大小为360~686 bp，而Boshoff等发现CVR片段大小为377~533 bp。2020年，Vilem等又进一步将基因II型分离株划分为GII-CVR1和GII-CVR2。不同毒株之间CVR序列信息和片段大小都有差别，这种多变性使得CVR不适合进行基因型划分，但在探讨国家、地区层面以及基因型间流行复杂性上可以发挥作用。目前利用B602L基因进行ASFV分析常与P72基因相结合，首先以P72基因进行基因分型，然后利用CVR进行差异分析，以进一步明确相同P72基因型内各个毒株的关系。
5 P54（E183L）基因分型
虽然早在1995年，Sun等就已证实P54基因在不同细胞传代株之间可以发生变异，但基于P54基因进行进化树分析的却不是很多。2008年，Rowlands等分析了2007年传入格鲁吉亚的ASFV，发现其P54基因序列与5株马达加斯加分离株和2株莫桑比克分离株完全一致，与之后分离的2株莫桑比克分离株在多个位点有差异，此结果对研究格鲁吉亚毒株的来源发挥了重要作用。2009年，Gallardo等同时利用P54、P72和B602L基因对肯尼亚2006—2007年流行的ASFV分离株进行了进化树分析，结果发现P54与P72的基因进化树基本一致，但在P72基因型最大分支基因I型中，P54基因型可进一步划分为4个分支，分别被命名为Ia、Ib、Ic和Id。Ia型主要来自欧洲和美洲，Ib型来自西非国家，包括Lisbon57毒株，而Lisbon60和Mzuki毒株则分别被划分为Ic和Id型。另有研究对赞比亚2005年分离株的P54基因进化分析，结果发现该毒株属于P54基因型 Id分支，提示引起此次疫情暴发的毒株可能来自赞比亚国内或南非区域。但进一步研究显示，赞比亚分离株的P54基因分型还曾包含有Ie、If、Ig、IIa、IIb、VIIIa、VIIIb、XI、XIII和XIV，提示赞比亚流行株包含了多个进化分支。目前，P54基因分型只作为辅助分析指标使用，可能原因是P54基因分型相比P72基因分型，差异不显著，且相比CVR分析，区分度不显著。
6 其他基因分型
除常利用P72基因、IGR位置、9RL/B602L基因和P54基因进行基因分型外，为更好地探讨毒株之间的进化差异，特别是同一个区域内毒株的进化趋势，研究者还对P30（CP204L）、CD2v（EP402R）、TK（thymidine kinase）以及J268L、Bt/Sj、KP86R、O174L、C315R/C147L、K145R和MGF 505-5R等基因进行比对分析。Nix等对J268L、Bt/Sj和KP86R基因进行序列分析，结果发现不同分离株的基因长度和序列有部分差异，可以用于区分进化相近的分离株。Sanna等利用P30（CP204L）基因、IGR位置和EP402R基因对意大利撒丁岛流行多年的ASFV进行了基因分析，结果发现P30基因和IGR位置高度稳定，而EP402R基因却可以将毒株划分为2个分支——第一个分支为1978—1990年流行毒株，第二个分支为1990—2014年流行毒株，这提示ASFV流行株可能在不断提升的疫病控制和诊断技术水平下，受到选择压力的影响发生部分变异。2017年，Onzere等首次利用TK基因对ASFV流行株进行分析，结果发现2011—2013年的肯尼亚分离株与南非参考毒株有明显差异。2019年，Mazur-Panasiuk等通过全基因测序在波兰分离株中发现K145R和MGF 505-5R等基因中出现单个核酸序列改变导致的蛋白序列改变（single nucleotide polymorphism，SNP）。随后，通过对O174L基因、K145R基因和IGR位置进行同时测序和组合比对，将波兰毒株分为4个遗传进化群。这些研究提示，将上述“分子指纹”（molecular fingerprints）基因进行组合分析，可更深入地了解同一区域内毒株的流行演变规律。
7 血清分群研究
1963年，通过红细胞吸附抑制（hemadsorption inhibition，HAI/HADI）试验和感染猪交叉保护试验，科学家首次用试验数据证实ASFV存在抗原差异。随后对多株ASFV进行的HAI显示，ASFV之间的抗原差异可将ASFV进行分类或分型，并将具有血凝性的ASFV分为A、B和C共3个亚型。但这种分型方式没有继续使用下去，可能原因是HAI试验需要活病毒和恢复期血清，而ASFV的高致死率无法持续获得血清转化的存活家猪，且针对HAI的抗体产生时间较晚，滴度较低。因此，探索HAI血清分群机理，查找HAI血清分群抗原决定簇显得尤为必要。经过众多研究者的不断努力，最终证实CD2v（EP402R）和EP153R（C-type lectin）基因与ASFV的HAI紧密相关，且该区域为ASFV基因组序列中变异较大的区间。随后，俄罗斯VNIIVViM研究所进行了更深入长久的研究，并最终基于CD2v和C-type lectin蛋白编码基因的特定区域序列比对，将ASFV划分为至少8个血清群。经与P72基因分型比较，Malogolovkin等发现：P72基因分型与基于CD2v和C-type lectin的血清分群在相对有限区域内（如南非地区的分离株）差异较大；相反，在一些只有单一基因型疫情暴发的非疫源地国家，分离毒株的基因分型和血清分群无显著差异；同时，同一个基因型内也可能包括多个血清群，如血清I型、II型、IV型都可被划分到基因I型中，说明欧洲大陆分离的ASFV毒株有多种来源背景。以上结果进一步说明，在某些情况下，标准的P72基因分型可能无法有效区分相似来源背景的ASFV毒株。
8 结语
ASFV基因分型与血清分群都是基于特定的基因序列比对分析所得，目前通过常规PCR扩增和核苷酸测序比对分析可以很快确定ASFV基因分型与血清分群。ASFV基因组较大，所以ASFV在不同细胞系、宿主体内（特别是在野猪和软蜱）复制传代时，容易造成基因组末端可变区和中央可变区发生序列插入和缺失。而P72基因相对保守，所以当只有一个毒株在一定区域内流行时，一般不会发生基因型变化，因此P72基因分型是国际最通用、快速、方便的分型方法，并且仍是病毒新传入某区域后进行鉴别诊断的首选方法。其他基因分型及血清群分析，因这些基因变异性相对更强，故可有助于分析ASFV分子流行病学变化和预判毒力演变。研究ASFV基因分型可以有助于从分子水平追溯引发疫情的病毒来源，掌握潜在的传播途径及可能的传播方式。
目前非洲流行的ASFV包含所有的24个基因型，且主要分布在东非和南非。中非主要流行基因I型和II型，西非部分国家主要流行基因I型，而北非尚无疫情报道。20世纪60年代在西欧国家流行的毒株主要是基因I型，2007年传入格鲁吉亚并扩散到俄罗斯、东欧诸国的毒株是基因II型、血清8群。我国ASFV流行株和亚洲流行株也是基因II型、血清8群。因此，研究ASFV基因分型和血清分型有助于从分子水平追溯引发疫情的病毒来源，掌握潜在的传播途径及可能的传播方式，对于该病的流行病学分析具有重要意义。
