广告
自2015年之后，规模化养猪场诊断实验室逐渐配置了分子生物学诊断设备（从早期的PCR逐渐过渡到qPCR），尤其是2018年非洲猪瘟之后，为了快速诊断与精准剔除，纷纷配置了荧光定量检测设备，用于潜在感染病原的分子生物学快速、精准的诊断（尤其是非洲猪瘟、蓝耳病等），今天跟各位聊聊分子生物学检测过程中的一些基本概念，检测结果应用等，便于各位临床兽医对实验室结果的解读与综合诊断应用。
本文重点在第三部分。
一、qPCR、CT值等一些基本概念
1 qPCR检测的原理
以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。检测的Ct 值和该模板的起始拷贝数的对数之间存在线性相关。普通PCR是定性的检测方法，而qPCR（又称为 real time PCR）是半定量检测方法。
2 Ct值是什么？
非洲猪瘟之后，因为qPCR技术的广泛应用，行业人士都知道了“CT值”一词，也知道了“起峰”的基本含义。但什么是CT值呢？
qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。CT值越小，代表初始模板中目标基因的浓度越高；CT值越高，代表初始模板中目标基因的浓度越低，通常CT值的合理范围是15-35之间。
3 基线（Baseline）
是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。所以在qPCR的结果图中，若试剂盒或反应体系较好的话，前面的图形应该是直线。
4 荧光域值（threshold）的设定
一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。
在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。
5 Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板在不同时间扩增或同一时间不同管内扩增（有时候会受到八连管的质量，反应体系的混合均匀度，加样的操作等影响），得到的Ct值是恒定的。
通常认为，CT值的重现性受到人工操作、提取效率、扩增效率等影响，也是检测提取试剂盒与扩增试剂盒品质的关键性指标之一。
也可以使用同一份样品在不同实验室的CT值的重现性来验证不同实验室之间的检测能力的差异性。若样品是标准品更佳（维特康实验室出售实验室验证用标准品，若需要，请联系）。
二、CT值与病毒载量的关系
在很多情况下，我们更需要知道病毒载量，以判断猪群的发病阶段或感染压力。
1 什么是病毒载量？
病毒载量(viral load，VL)代表的是某一载体中病毒负荷量，比如血液中的病毒载量（病毒血症）即指的血液中病毒负荷量。对于具有病毒血症的病原来讲，血液中病毒载量的高低是衡量疾病进展的标志，对疾病的传播能力、发展阶段、分期预后估计、疗效观察均有很高的参考价值。
很多疾病的病毒血症期很短，比如PRRSV病毒在成年猪体内的病毒血症期只有7-10天左右。也就是说，感染成年猪7-10天之后，血液中的病毒载量可能是0，但病毒载量是零，并非意味着猪只不携带病毒，可能在组织内依然存在病毒。研究表明：不同毒力的非洲猪瘟病毒的病毒血症期差异也较大，通常认为，毒力越弱，病毒血症的持续期越短，病毒血症在感染后的呈现时间约晚。
2 病毒载量与CT值之间的关系什么？
病毒载量多少可以通过qPCR方法进行测量，是以拷贝（copies）为单位，计算每一毫升（ milliliter）有多少病毒量，如 copies/ ml，通过建立的标准曲线通常以CT值表示。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。qPCR检测到的仅为病毒核酸的多少（可能是死亡的病毒核酸片段），其并不能完全代表感染力大小，若要明确病毒的感染力则需要进行细胞或动物活体实验（病毒活力/毒价一般用TCID50/mL（比如PRRSV）、HAD（比如ASFV）等表示）。临床生产中，用qPCR方法对血液、组织处理液、唾液、组织中的病原进行核酸检测，可以反映体内病毒复制（病毒数量）情况；用qPCR方法对车辆、人员、物资等环境样品进行检测，可以反映样品曾暴露（接触）过病原的情况，是否具有感染活力或者传播性，则需要通过细胞培养的方式进一步评估，其更重要的意义体现在生物安全风险的评估、疾病暴发的提前预警以及疾病暴发后的溯源。
CT值与病毒载量的线性关系与样品的提取效率、扩增效率、样品种类、探针引物、反应体系等多因素相关。需要在实验室内，使用某一固定品牌或品类的诊断试剂，通过批内、批间实验进行不断优化，针对已知病毒含量（一般为质粒）的扩增模板，描绘出标准曲线，从而推断出特定CT值所对应的病毒含量。
3 为何有时病毒检测结果为“测不到”？
每一种检测方法都有检测阈值（敏感性），比如qPCR方法检测血液或其他样品中某一种病毒的数量其最低值是50 copies/ml，则任何血液样本或其他样品中该病毒的载量低于这门坎表示病毒量低于可测量的限度，报告中一般显示低于测量值，就是说“测不到”。这并不表示血液或其他样品中没有病毒，而是病毒量在0与50 copies/ml之间，因数量太低，仪器无法测出。但是，血液“测不到”的病毒还是会广泛存在于精液、阴道分泌物、骨髓、内脏中，可能猪只依然具备传播性，从而传播疾病，如：蓝耳病毒、非洲猪瘟病毒等。
根据检测方法的不同，病毒载量的单位常为：copies/mL，或 TCID50/mL。
4 Ct值的正常范围是多少？
Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。
对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。
对于CT值大约35的结果解读：在实际检测过程中，环境样品、非洲猪瘟疫苗毒感染样品等，因为病毒含量较低，可能会出现CT值大于35的结果（CT值在35-40之间），这种结果的临床解释要谨慎，需要认真考虑样品的种类、猪只临床表现及对结果重复采样检测后的重复性等。对于CT值在35-40之间的结果，往往重复检测时，重复性较差。
5 复孔间重复性差
为了增加检测结果的可靠性，我们可以对同一样品设定复孔进行检验。
首先，谈谈复孔间重复性差的问题，复孔间重复性差一般会有以下两种情况：
（1）Ct值＜30，重复性较差。这种情况与操作有一定关系。
这种情况可以从以下几个方面分析：加样准确度、移液器吸取液体的准确度、定期校准qPCR仪。
a. 加样准确度
避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBR Green Mix或Probe Mix、ddH2O配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液cDNA添加1μL，可以更改为原液cDNA稀释5倍，添加5μL，使用 ddH2O补齐体系至20μL即可。
SYBR Green Mix或Probe Mix、配置的混合体系需要混合均匀。从-2℃0 ℃ 冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在一起的Mix用移液器吹打混匀。
b. 移液器吸取液体的准确度
移液器量程定期校准，校准周期为1年。
购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导致吸取量程不准确。
在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。
C. 定期校准PCR仪
一般每一年都需要对PCR仪校准一次。
（2）Ct值＞30，重复性差。这种情况符合松柏分布，即在有效模板很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的Ct值差异较大。
三、CT值与病毒载量的临床诊断与紧急处置应用
通过CT值，只能粗略的判断样品中病毒载量的大小，通常正常范围的数值是15-35之间。若CT值在15-20之间，说明样品中目标基因片段的含量很高。这对于圆环病毒病的致病性诊断有指导性意义。对于感染非洲猪瘟的猪的血液与组织样品的CT值通常在20-30之间，若CT值过高（如：30-40之间），或者疾病处于早期，或者需要鉴定是否是因为非洲猪瘟弱毒（变异毒株感染）感染所导致的。
一般而言，对于多数病原而言，血液的CT值最低，病毒含量最高，唾液样品中的CT值要稍低些，而环境、物资、人体等样品的检测CT值一般比较高，说明病毒含量比较低。故作为临床兽医或生物安全管理者，不能单纯的依照qPCR的CT值来判断物资或人员是否有传染病毒的风险。可能是因为样品中的病毒含量较低，但可能依然具备感染性，提示我们必须认真的做好生物安全措施。
qPCR给非洲猪瘟、新冠病毒的防控、紧急处置提供了非常大的帮助，但不能以qPCR的结果作为猪群是否感染的唯一标志。笔者曾经遇到一个案例，连续5天猪剩料，但qPCR检测结果始终检测阴性（临床与实验室检测结果出现不一致性！请参考2021年2月份文章：精准拔牙只靠testing吗？），但第6天，尾根血拭子的qPCR值是20-25之间，这也说明拔牙不能只靠qPCR检测，通常需要结合临床表现+实验室检测结果综合判断非洲猪瘟的感染风险。
其实圆环病毒感染的诊断依据类似（临床症状+病变+检测的病毒含量）。因为圆环病毒感染的广泛性，需要在组织样品中检测到高含量的圆环病毒，并出现圆环相关的临床症状，结合仔猪的圆环免疫状态，才能做出最终综合诊断。
更多问题，请咨询博维特下属维特康检测实验室，我们正为行业提供具备CNAS检测资质的非洲猪瘟的检测服务。
若一旦非瘟阳性，博维特的技术顾问必定奔赴一线，使命必达！让我们利用好实验室诊断、临床紧急处置与日常监控的手段，一起构建强大的健康管理体系。
