非洲猪瘟疫情在全球呈蔓延趋势，疫苗研究极为迫切。ASFV Georgia 2007分离株(ASFV-G)是造成目前欧洲和亚洲疫情的主要毒株。含有病毒相关基因缺失的ASFVs可以在猪体内产生减毒表型和诱导保护性免疫。
美国学者Elizabeth Ramirez-Medina等人在前人所做研究的基础上做了一些探索，试图产生安全有效的基因缺失减毒活疫苗，结果并不理想。
本文对ASFV的毒力影响因素进行了探讨。作者认为合理开发新型ASFV疫苗需要谨慎，避免直接将特定病毒株的特定基因缺失所获得的结果传播到新的野外病毒株。
ASF是猪的一种传染性病毒性疾病。ASFV是一种大包膜病毒，含有约190kbp配对的双链DNA基因组。ASFV与其他大型dsDNA病毒（例如痘病毒科，虹膜病毒科和藻类病毒科）具有相同的基因组结构和复制策略。ASF引起的一系列疾病，从高致死到亚临床症状，均取决于宿主特征和病毒株的毒力。家猪的ASFV感染通常是致命的，以高烧，出血，共济失调和严重抑郁为特征。
目前疫苗研发取得了一些进展。研究表明，当同源亲本病毒攻击时，用含有特定病毒相关基因缺失的减毒活疫苗免疫的可以猪受保护。ASFVs病毒基因组中缺失UK（DP69R）基因、23-NL（DP71L）基因、TK（A240L）基因、9GL（B119L）基因、 MGF360-530的6-9基因和DP148R基因，可导致对猪的毒性减弱。使用经过修饰的重组病毒免疫的动物，在受到其同源亲本病毒的感染时能够免受疾病的侵袭。到目前为止，这些研究结果是合理开发减毒病毒株的实验证据。
基因缺失可能成为合理开发针对不同分离株的减毒活疫苗的方法学基础。然而，大多数基因缺失，仅在少量的病毒分离物中进行了测试。将高度保守的9GL基因从三个不同ASFV菌株（Malawi, Pretoria和Georgia 2010）中敲除，导致了不同效果的毒力衰减。缺失NL基因完全减弱了E70菌株的毒力，但没有影响Malawi中的毒力。敲除UK，DP148R和两种不同类型的MGF360-530，仅在一种病毒分离株中进行了评估。
与毒力相关的病毒基因的识别和鉴定，对于ASFV疫苗的开发是至关重要的。我们研究了ASFV Georgia 2010 (ASFV-G)菌株缺失NL (DP71L)和UK (DP96R)两个病毒基因后的差异，这两个基因最初被认为是ASFV E70株病毒毒性的决定因素。
我们试图通过删除NL基因来增加以前报道的实验性疫苗ASFV-GΔ9GL/ΔUK的安全性，产生基因缺失病毒ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK。虽然ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK可以在猪巨噬细胞的原代细胞培养中复制，但它在猪中表现出严重的复制缺陷，未能诱导针对亲代ASFV-G感染的保护作用。
尽管两种病毒基因的氨基酸序列在E70和Georgia毒株之间是高度保守的，但我们的结果显示，与亲本病毒相比，ASFV-G基因组的UK缺失（ASFV-G-ΔUK）毒力并没有降低。NL基因的缺失使ASFV-G部分减毒。我们得出结论，这两种病毒基因的差异效应取决于病毒基因组中的其他因素。
细胞培养与病毒
从去纤维蛋白的猪血液中制备原代猪巨噬细胞，进行培养。
ASFV Georgia（ASFV-G）是由佐治亚州第比利斯农业部（LMA）实验室的Nino Vepkhvadze博士友情提供。
重组病毒的构建
感染和转染猪巨噬细胞后，亲本ASFV基因组与相应重组转移载体同源重组，产生重组病毒ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK。
利用病毒ASFV-G 9GL和重组转移载体p72mCherryΔNL/ΔUK，构建三基因缺失的ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK。
ASFV基因组的新一代测序（NGS）
从感染的细胞中提取ASFV DNA并如前所述进行定量。使用Illumina NextSeq测序仪测定病毒基因组的全长序列。
ASFV特异性抗体检测
采用自行研制的ELISA法对感染动物血清中的ASFY抗体进行定量。
动物实验
根据美国农业部和国土安全部动物保护和使用委员会批准的方案，在梅兰岛动物疾病中心(PIADC)的动物设施中，3AG级生物安全条件下进行动物实验。使用80-90磅的商业品种雌性猪评估ASFV-G-重组病毒相对于亲本ASFV-G病毒的毒力。每组5只,肌肉（IM）接种104HAD50重组病毒或ASFV-G。在整个实验过程中每天记录临床症状（厌食，抑郁，发热，紫色皮肤变色，蹒跚步态，腹泻和咳嗽）和体温变化。
通过肌肉注射102HAD50高毒亲本ASFV-G，评估ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在接种28天（dpi）后的保护作用。在整个实验中每天记录临床体征（如上所述）和体温变化。
结果
ASFV NL（DP71L）和UK（DP69R）基因在E70分离株和Georgia 2010分离株中高度保守
从西班牙分离株E70的基因组中单独删除NL（DP71L）或UK（DP69R）基因，导致在实验条件下接种于猪中病毒的毒力急剧下降。有趣的是，E70和Georgia 2010分离株之间基因的序列比较显示出高度的保守性。NL（DP71L）和UK（DP69R）基因的氨基酸同源性分别为94％和96％（图1）。此外，共有39个预测的ORF可用于UK（DP69R），并且观察到28个预测ORF保持高比例的同源性（>90％）;7个在80％和90％之间，4个在70-80％之间。在NL（DP71L）中，39个预测的ORF保持高百分比的同源性（>90％）。E70和Georgia 2010分离株之间，这两个基因具有高度同源性，将预测它们在Georgia 2010基因组中的个体缺失将在ASFV Georgia 2010感染的猪中具有相似的降低病毒毒力的表型。
图1.从ASFV E70和Georgia 2007分离株获得的全长非洲猪瘟病毒（ASFV）蛋白NL（DP71L）（A）和UK（DP96R）（B）的氨基酸序列的比对。
重组缺失突变体ASFV的构建
为了评估NL（DP71L）或UK（DP69R）基因对于病毒毒力的影响，使用ASFV-G作为亲本病毒构建重组病毒，所述病毒单独含有任一基因的缺失（分别为ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK）。
通过对高致病性ASFV Georgia 2010分离株的遗传修饰，与重组质粒p72mCherryΔNL的同源重组，构建ASFV-GΔNL（图2）。从ASFV-G病毒中删除NL（DP71L）基因内包含氨基酸残基1-52 AA的156bp区域，并通过同源重组用含有在ASFV p72晚期基因启动子控制下的mCherry基因的基因盒替换（p72mCherry ）。使用ASFV-G作为模板和p72mCherryΔUK作为重组质粒，构建ASFV-GΔUK。敲除UK基因（DP69R）中包含氨基酸残基1-85的255 bp区域，并用p72mCherry盒替换（图2）。
图2.在重组病毒ASFV-G-ΔNL，ASFV-G-ΔUK和ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK中缺失的NL和UK基因区域的示意图。虚线之间的区域用p72mCherry盒代替。核苷酸位置表明了相对于ASFV-G基因组的缺失边界。
利用原代猪巨噬细胞培养的单层细胞，连续纯化后获得重组病毒。在原代猪巨噬细胞培养中扩增纯化得到的病毒群，获得病毒库。
通过对每种重组缺失突变病毒进行全基因组测序，评估遗传修饰的准确性，每种重组病毒基因组的完整性和原病毒种群的纯度。使用获得的ASFV-G-Δ9NL和ASFV-G-ΔUK的全基因组序列，并与亲本ASFV-G的基因组进行比较。对两种病毒的DNA序列的分析证实了设计的缺失的准确性，并且通过插入与p72mCherry盒相对应的核苷酸进行替换。
ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK在原代猪巨噬细胞中的复制
在原代猪巨噬细胞培养中评估ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK的体外生长特征，利用多步生长曲线与亲本ASFV-G进行比较（图3）。以0.1 MOI感染细胞，并在第2,24,48,72和96 h收集样品。结果表明，ASFV-G-ΔUK显示出与亲本ASFV-G病毒相似的生长动力学。根据感染巨噬细胞的时间点和MOI，我们发现，重组病毒表现出与亲本病毒相似的滴度。ASFV-G-ΔNL表现出略微的复制减少。滴度比ASFV-G或重组ASFV-G-ΔUK低约10倍，但三种生长曲线之间没有统计学差异，除了96 h时（p值=0.003），ASFV-G-ΔNL较低。在ASFV E70的背景下通过缺失NL 或UK基因获得的结果，不影响病毒在原代猪巨噬细胞培养物中体外复制的能力。
因此，虽然删除UK基因似乎不影响病毒在E70或Georgia分离株中复制，但与E70分离株中的同源基因的效果相比，Georgia分离株中NL基因的缺失似乎对巨噬细胞中的病毒复制具有轻微的不利影响。
图3.重组病毒ASFV-G-ΔNL，ASFV-G-ΔUK，ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK和亲本ASFV-G的体外生长动力学。用重组病毒或亲本ASFV-G病毒感染原代猪巨噬细胞（MOI=0.1）。在原代猪巨噬细胞培养中，用滴定法测定感染后指定时间的病毒产量。
NL (DP71L)或UK (DP69R)基因缺失对猪ASFV-G毒力的影响
从西班牙分离株E70的基因组中单独删除NL（DP71L）或UK（DP69R）基因后，在实验条件下感染猪后，导致病毒毒力急剧下降。在这些报道中，观察到肌肉注射重组缺失突变体的猪，当剂量高达104HAD50时，只会引起短暂的体温升高。因此，我们决定评估相似的基因缺失是否同样会影响高毒性ASFV-G分离株的毒力。ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK病毒接种在家猪中进行实验，并与其亲本强毒病毒进行毒力比较。
肌肉注射104HAD50ASFV-G的猪，4-5天内表现出体温升高（>104°F）。猪发展出与该疾病相关的严重临床症状，包括厌食，抑郁，紫色皮肤变色，步态蹒跚和腹泻。随着时间的推移，疾病的迹象迅速恶化，动物死亡或在5-6天濒临死亡时被安乐死（表1）。
表1. 与感染亲本ASFV-G病毒相比，感染突变病毒ASFV-G-ΔNL或ASFV-G-ΔUK猪的存活率和发热反应。
用肌肉注射104 HAD50ASFV-G-D9UK的动物，表现出与亲本病毒ASFV-G感染的动物中观察到的、严重程度相当的临床疾病。攻毒3-4天后，猪开始出现短时间的发烧，第5天时，动物死亡或因濒临死亡而安乐死。有趣的是，肌肉注射104HAD50ASFV-G-Δ9NL的动物呈现异质行为。一只动物在第5天时突然死亡，在尸检时出现与超急性疾病相似的临床病变。剩余的四只动物，起初的21天在临床上保持正常，与感染了亲代病毒的动物相比，出现了迟发性亚临床疾病。攻毒后第4天，开始出现短时间的发热，然后在整个观察期内出现周期性的体温短暂升高（表1，图4和5D）。
图4.感染104HAD50的重组病毒ASFV-G-ΔNL，ASFV-G-ΔUK或亲本ASFV-G动物的死亡率的变化。感染后21天的观察期监测动物的动物死亡率。
通过HA定量检测实验动物感染病毒后，不同时间节点的病毒血症（图5A-C）。感染亲本ASFV-G毒株的动物，具有非常高的病毒血症直至其死亡。与感染ASFV-G的动物相比，感染ASFV-G-△UK的动物在血液中具有比较高的病毒滴度，平均滴度仅在接种第4天时略微降低。根据临床表现，在感染ASFV-G-ΔNL的组中，接种第5天时，死亡的动物呈现高病毒血症滴度，而其余存活的四只动物呈现异质反应。
其中一只从第7天开始至观察期结束，病毒血症滴度恒定较高（约106.36HAD50/mL，标准差为0.24）。第二只动物表现出相似的动力学，平均滴度为104.99HAD50/mL，标准差为0.55，而第三只动物的平均滴度为103.61HAD50/mL，标准差为0.82。这三只动物的体温都有周期性的短暂升高。最后，第四只动物在测试的任何时间点都没有出现任何可检测的病毒血症。因此，病毒血症值与临床疾病表现的严重程度和动力学密切相关。
图5. ASFV-G（A），重组病毒ASFV-G-ΔUK（B）和ASFV-G-ΔNL（C）感染后病毒血症的滴度。（D）接种ASFV-G-ΔNL的猪的体温变化。
令人惊讶的是，UK基因的缺失并没有改变ASFV-G分离株的毒力，而NL基因的缺失不能完全减弱病毒毒力。考虑到E70和Georgia 2010分离株之间，NL和UK基因之间的高度同源性，强调了这两个基因在ASFV毒力中的遗传背景的重要性。
候选疫苗ASFV-G-Δ9GL/ΔUK中NL基因的缺失影响了其对亲本病毒的保护作用
由于NL的缺失诱导了ASFV-G毒力的显著降低，因此需要评估是否NL缺失会增加候选疫苗ASFV-G-Δ9GL/ΔUK的安全性。在此基础上，通过从ASFV-G-Δ9GL/ΔUK基因组中删除NL基因，开发了一种新的重组病毒ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK。通过NGS分析ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK基因组与亲本ASFV-G-Δ9GL相比，唯一的基因组修饰是插入的p72mCherry盒取代NL和UK基因。
在猪巨噬细胞原代培养中进行了多步生长曲线实验，评估ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在猪巨噬细胞中的体外生长能力，并与其他重组病毒和亲本ASFV-G进行比较。结果表明，与ASFV-G-Δ9GL/ΔUK相比，ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的生长动力学减少约100倍，与亲本ASFV-G病毒相比，减少1000倍（图3）。
为了评估NL基因缺失对ASFV-G-Δ9GL/ΔUK保护作用的影响，肌肉注射104 HAD50于动物体内（n=5），并在28天后，感染102 HAD50的ASFV-G。结果发现，所有接种的动物在感染之前没有临床症状。病毒血症动力学显示ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK的复制水平非常低（图6），与先前描述的ASFV-G-Δ9GL或ASFV-G-Δ9GL/ΔUK的复制水平不同。因此，由ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK感染引起的特异性ASFV抗体应答非常低（数据未显示），与ASFV-G-Δ9GL/ΔUK诱导的反应相比大大降低。
图6.用104HAD50的ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK感染后血液样品中的病毒滴度。
病毒接种后，所有ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK免疫的动物与对照组动物出现一致的、在动力学和严重程度上难以区分的临床疾病。两组中的动物第4天时表现出临床症状，并且被6天时执行安乐死（表2）。同时，模拟接种疫苗的对照和ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK感染的猪之间的病毒血症的动力学或量级没有检测到差异。这些结果证明NL基因的缺失降低了ASFV-G-Δ9GL/ΔUK候选疫苗在细胞培养和体内复制的能力，并没有诱导针对亲本毒性病毒攻击的保护。ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在猪体内的低复制可能是其对强毒病毒的保护作用较差的原因。
表2 感染ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的动物的生存率和发热反应，并在28天后接种102 HAD50的亲本ASFV-G。
讨论
目前为止还没有疫苗可用于预防ASFV感染，已有报道减毒活疫苗可用于保护猪免受同源强毒株的攻击，病毒通过细胞培养中的连续传代以及遗传基因突变产生致弱。通过基因工程获得的减毒病毒通常涉及与病毒毒性相关的特定基因的敲除。
迄今为止，只有6种不同基因/基因组的独立缺失能够减弱ASFV的毒性：
ASFV E70分离株中NL（DP71L）或UK（DP69R）基因独立缺失；
Malawi Lil-20/1，Haiti，Georgia 分离株TK (A240L)基因的敲除；
Malawi Lil-20/1，Pretoriuskop/96/4和Georgia分离株中9GL（B119L）基因的敲除；
Georgia和Benin分离株MGF360/505的6或9个基因缺失；
Benin分离株中DP148R基因的缺失使重组缺失突变病毒在猪体内的毒力显著降低。
这些候选毒株当受到相应的毒性亲本病毒 (同源攻击)的感染时能够提供免疫保护。这些研究结果表明，通过对靶基因的基因调控来开发减毒重组病毒是一种有效的疫苗开发方法。不同ASFV分离株之间的交叉保护是一种非常罕见的，需要开发不同分离株特异性疫苗。由此提出了一个问题，即在不同的病毒分离株中，一个特定基因缺失的衰减效果是否可以重现。在这方面，尚缺乏深入的研究。
TK (A240L)基因是所有ASFV分离株中高度保守的基因， Vero细胞适应型Malawi Lil-20/1，Haiti H811和Georgia病毒获得相似的毒力衰减水平，即使它作为潜在疫苗病毒的作用不同。
9GL（B119L）基因在目前测序的ASFV分离株中也是高度保守。从致命的Malawi Lil-20/1和Pretoriuskop/96/4中敲除该基因，有效地降低了病毒毒力，并诱导相应的保护作用，这是一种候选靶基因以产生减毒活疫苗。然而，最近的研究表明，在Georgia分离株中，9GL的缺失在毒力衰减方面没有同样的效果，因为只有当以低剂量接种时，才能观察到9GL缺失的Georgia分离株的病毒毒力显著降低。
NL基因在不同的病毒分离株中存在很大差异。有趣的是，NL基因以两种不同的形式存在：长型（184氨基酸），在Malawi Lil-20/1分离株中发现，以及短型（70-72氨基酸），存在于迄今为止测序的大多数ASFV分离株中。在ASFV E70分离株（短型）中缺失该基因产生减毒病毒，而其在ASFV Malawi Lil-20/1（长型）中的缺失不会导致病毒的减毒。E70和Malawi Lil-20/1编码的NL蛋白显著不同，这可能解释了分别接种缺失突变病毒的猪的表型差异。然而，NL基因和UK基因的短型，在所有ASFV分离株中都非常保守。蛋白质同源性表明NL和UK蛋白在ASFV分离株中高度相似，其中E70和Georgia分别具有超过94％和96％的氨基酸同源性，使得ASFV减毒不可能仅依赖于蛋白质分化。由于观察到的表型很可能是多个基因的作用共同介导的，目前为止积累的证据很难推测在ASFV Georgia 2007分离株中究竟是哪些基因介导了毒性。在不同的ASFV毒株中，病毒相关基因的数量或功能可能改变NL和UK基因对特定毒株毒力总体平衡的内在作用。
虽然有研究表明，ASFV-G-D9GL候选疫苗的衰减增强，但UK基因本身并不是ASFV格鲁吉亚分离株毒力的决定性因素。同样，NL在ASFV-G分离株病毒毒力中的重要性并不完全类似于ASFV E70，这表明其他与病毒相关的基因可能与Georgia分离株病毒毒力有关。正如观察到Malawi Lil-20/1，Pretoriuskop/96/4和Georgia分离株中9GL基因的缺失导致不同的表型，NL和UK基因的缺失也产生了类似的结果，表明ASFV毒力是多基因效应的结果。这些结果表明，在从两个不同的ASFV基因组中删除毒力相关基因后观察到的差异表型效应取决于病毒分离株的基因组背景。
支持这一假设的证据是，ASFV毒株中插入一组MGF360/530，可以恢复删除NL基因后的ASFV E70毒株的衰减。由于MGF基因的自然缺失，NL基因的缺失导致了ASFV E70分离株的表达减弱，这组MGF基因后来被证明是病毒毒力的关键。
因此，尽管E70和格鲁吉亚病毒分离株的UK和NL基因的翻译产物具有很高的氨基酸同源性，但其他遗传因素也影响了ASFV的毒力。这些毒力的遗传决定因素需要进一步的鉴定。这项工作表明，合理开发新型ASFV疫苗需要谨慎，避免直接将特定病毒株的特定基因缺失所获得的结果传播到新的野外病毒株。
