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猪精液的冷冻保存不仅可实现优秀种公猪精液的跨时间、空间的调配，而且在优秀地方遗传资源的保护、遗传数据的收集等方面具有重要意义。然而，由于猪精子膜低胆固醇-磷脂比和高不饱和脂肪酸含量等特性，使其极易受到冷冻损伤，且冷冻过程中的影响因素和原理尚不完全明确，导致目前猪冷冻精液技术仍不成熟，在实际生产中的应用效果不理想。在精子的冷冻过程中，冷冻程序、冷冻保护液与解冻液的组成等都对猪冷冻精液的质量有重要影响。本文就猪精液冷冻过程中的冷冻损伤机制及冷冻保护策略进行探讨，以期为猪冷冻精液的开发与应用提供参考。
文 / 张司龙1,2，许晓玲1，刘克雄1，葛锁子3，蔺志延3，刘彦1，白佳桦1
1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所
2.酒泉市金塔县畜牧兽医技术服务中心
3.北京中育种猪有限责任公司
随着规模化养猪业的快速发展，人工授精技术被广泛应用于母猪繁殖生产。但是，在养猪生产更加规模化、工业化的新形势下，传统的常温精液辐射范围有限、应用时间短，无法满足更大批量生产中优质精液需求和优秀种公猪的跨区域调配，限制了优秀种公猪的种质资源优势的充分发挥。猪精液的冷冻保存不仅可实现优秀种公猪精液跨时间、空间的调配，而且在优秀地方遗传资源的保护与遗传数据的收集等方面具有重要意义。在动物疫病防控严峻的形势下，冷冻精液给疫病检测与防控留出充足时间，在生物安全方面具有愈发明显的优势[1]。相比于猪的常温输精，猪冷冻精液在生产应用中的受胎率、产仔数等指标仍有较大差距[2-4]。但随着养猪业集约化、工厂化生产模式的快速发展，如牛、羊冷冻精液现状一样，猪的冷冻精液应用将成为新的发展趋势。本文围绕猪精液冷冻保存损伤机制和保护策略进行探讨，以期为猪的精液冷冻技术研究和发展提供参考。
1 精子冷冻保存方法
猪冷冻精液是在精液采集检测后，经过等温稀释、离心浓缩、保护剂稀释、降温平衡、分装、冷冻，最后在液氮中冷冻保存，且在解冻后可恢复正常生理活性，满足生产上人工授精要求的精液[2-3]。常见的猪精液冷冻流程如图1所示，采集的公猪精液经品质检测合格后等温稀释，随后进行第1次降温平衡至17℃，通过离心浓缩去除精浆，加入冷冻保护液，第2次降温平衡至2～5℃，加入冷冻保护剂。分装细管后，通过干冰、液氮或程序降温仪进行冷冻，最终在液氮中长期保存。
图1 猪精液冷冻流程示意图
2 冷冻前的损伤机制与保护策略
精液冷冻前经历了采精、检测、稀释、离心浓缩、降温平衡等一系列处理过程，不同程度地影响冷冻精液的质量。
2.1 精液品质与检测
精液品质直接影响冷冻精液质量。采精后首先需要在37℃的条件下评估精子的活力、密度、畸形率、聚头状况、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位状态，前4项可在稀释后显微镜下观察，后3项需染色或化学检测评估，可使用荧光染料SYBR14、吉姆萨、荧光素-异硫氰酸酯结合的花生凝集素荧光标记（PNA-FITC）、混合碘化丙啶（PI）混合染色在荧光显微镜或流式细胞仪检测。为了获得理想的冷冻效果，通常筛选活力大于80%、畸形率小于15%、聚头状态少的精液进行超低温保存[5-7]。
猪精子质量与采集的季节、猪只个体健康状况均强烈相关。研究表明超过30℃连续的高温和昼夜温差大于10℃的环境（25～35℃），热应激会导致猪只精子质量显著下降（P<0.5）[8-9]。高温季节，在公猪日粮中添加多不饱和脂肪酸、维生素等添加剂有利于提高精液抗氧化能力，降低精子氧化损伤[10]。此外，研究表明公猪精液耐冻性筛选还与公猪品种以及STK17b、HECW2、Tex14、BOLL等基因表型有关，连续冷冻效果不佳的公猪应避免使用[15-17]。同时公猪年龄、采精频次、传染病等也会影响猪精子的冻后质量，公猪年龄过小或过大则采集到的精液质量差，采精频率过低则精液品质不稳定，频次过高影响公猪使用寿命和繁殖性能，传染病则影响猪个体健康和精子质量。因此，进行公猪精液冷冻应尽量避开炎热的夏季，选择2～4岁的公猪，每周采精2～3次为宜，注意疾病预防[5，7，14]。
2.2 精液稀释与浓缩
精液稀释可促进精子适应温度变化，减少温度变化对精子运动状态、结构和供能的损伤。在精液运输和常温保存中，最理想的稀释保存比例为1∶1～1∶2。无论是1∶1或是1∶2的体积比稀释，都应一次性稀释至目标浓度，多次稀释会使精子更易受到低温损伤[14-16]。
猪精液体积大、密度低，冷冻前需通过离心浓缩再添加冷冻保护剂。精清中如芳基硫酸酯酶、磷脂酶或类磷脂酶的存在已被证明与精子的敏感性有关，碱性蛋白与细胞膜的结合会破坏精子膜稳定性[17-18]，离心能分离活跃精子与死亡、聚头的精子，有利于除去精浆、浓缩精子，方便冷冻保护剂的添加和确定冷冻终浓度，以更好地应对冷冻造成的损伤[19]，是精子冷冻保存的重要步骤。
离心的次数、转速、再悬浮都会对精子造成机械损伤，使精子顶体、尾部、膜结构、酶活性等受到影响。研究表明，采用800×g（rcf）离心10～20min对猪精液离心浓缩能够获得较高的收集率，CARVAJAL G等人的研究中发现使用2400×g离心3～5min或1600×g离心5min同样能获得高精子回收率，精子结构、质膜、顶体等指标均表现良好[20-21]。此外，Percoll密度梯度离心，可通过胶体浓度的变化达到不同的精子离心效果，减少机械损伤，提高冷冻-解冻后猪精子的活力、膜完整性和体外受精能力。MATÁS C等人的研究表明使用碘二沙醇缓冲法（60% w/v）也能较好降低精子在离心过程中的损伤[21-22]。
浓缩后的精液还需添加冷冻保护剂稀释至最终冷冻浓度，在以往的研究中4×108～1.5×109个/mL的最终精子浓度进行超低温冷冻均可获得较好的冷冻效果[20,23-24]。
2.3 降温平衡
猪精子膜流动性、渗透性易受温度影响，导致其温度敏感的因素包括膜胆固醇比例低而磷脂含量高、不饱和脂肪酸含量高、精浆中抗氧化物质含量少等。随着温度的降低，精子膜发生从流体向凝胶转变，伴随着膜流动性与渗透性的降低，膜结构的线粒体功能受损，释放的过量活性氧簇通过攻击脂质、蛋白质和核酸，破坏精子能量代谢过程，影响结构和功能，从而造成精子质量的降低[25]。
精子在收集后要经历2次缓慢降温平衡。第1次从体温降温至15～17℃平衡3h以上，这一过程可能通过平衡或维持精子脂质结构，使精子质膜保持稳定状态[16]。Yeste等认为精子在平衡期间变得更耐低温的原因与热应激相关的精子蛋白的磷酸化有关[26]。第2次缓慢降温至4～5℃平衡，使精子能更好适应温度变化，进一步提高精子对低温的耐受性。有研究者使用程序降温仪以0.1℃/min速率缓慢降温120min的方法缓慢降温；也可采用卫生纸、毛巾包裹或直接放置于4℃冰箱降温2～2.5h的方法[15,27-28]。
2.4 冷冻稀释液保护剂
冷冻稀释液的成分主要包括能量物质、盐类物质、冷冻保护剂、抗氧化剂、其他保护添加剂等。能量物质有维持精子存活的供能物质，如葡萄糖、果糖、蛋黄等。盐类物质主要为维持pH、渗透压及生物活性的碳酸氢钠、柠檬酸、氯化钠、氯化钾等[29]。冷冻保护剂包括增加黏稠度、降低冰晶刺破损伤的甘油和糊剂等，冷冻前精液样品的浓稠度影响冷冻过程中冰晶造成的质膜物理损伤，适当添加糊剂有益于精液的冷冻保存，添加3%～8%的甘油有益于有效保存解冻后精子的功能（活力、活率和顶体完整性），但过早的添加以及过多高的甘油比例都对精子冷冻保存有害[30-32]。
抗氧化剂有酶促抗氧化剂和非酶促抗氧化剂2种类型，都可以中和冷冻过程中产生的过量活性氧，防止其破坏细胞结构。酶促抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶等。非酶抗氧化剂也被称为“自由基清除剂”，包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽、低牛磺酸、硒和褪黑素等。近年来，还有学者将抗冻蛋白、迷迭香酸、白藜芦醇等用于猪精液冷冻，取得了较好的抗氧化效果[33-34]。
3 冷冻过程中的损伤机制与保护策略
3.1 冷冻方法和降温速度
猪精液冷冻需跨过2个重要阶段，第1个阶段是从0℃降至-15℃，是精子内的水形成冰晶的阶段。冰晶容易破坏质膜和DNA结构，精子冷冻物理损伤多在此期间发生[19,31]，因此，这一降温阶段需缓慢进行。第2个阶段是从-5℃降至-30℃，是甘油、糊剂等凝结的阶段[35]。糊剂增加冷冻精液黏稠度，适当提高冷冻保护剂的黏稠度有利于降低冷冻时大颗粒冰晶对细胞膜的破坏，但其自身凝结形成的晶体仍然对猪精子存在伤害。跨越这2个重要阶段后精子冷冻状态趋于稳定，物理损伤因素减少，则需采取快速降温的方法抑制精子代谢活动，最终完成冷冻[30,36]。
猪精液冷冻处理主要有干冰冷冻法、液氮熏蒸法和程序降温法3种方法。干冰冷冻法是将精液细管水平放置在干冰表面10min，然后直接投入液氮保存直到解冻；液氮熏蒸法是将细管水平放置在液氮表面以上3～4cm处15～20min，最后投入液氮中保存[31]；相比前2种方法，程序降温仪对降温速度的控制更为精准，常见的冷冻程序分别在精子降温至5℃与2℃时开始处理，按照设定的程序分段降温至-140℃至-150℃（图2），再转移至液氮中保存[28]。
图2 2种猪精子程序冷冻降温步骤图
3.2 冷冻损伤和保护剂
冷冻过程的损伤以物理损伤为主，物理损伤也会进一步导致化学损伤和自身氧化损伤。物理损伤是造成精子冷冻死亡的最直接因素，主要由精子离心浓缩时造成精子结构的损伤和冷冻时形成冰晶破坏精子膜结构造成的损伤。质膜结构破坏导致精子渗透压改变，引起化学损伤和精子死亡[37]。同时膜结构损伤导致线粒体电子传递链破坏，释放过量的活性氧，与磷脂、氧化酶中的巯基和其他蛋白质发生反应，进一步造成精子膜损伤、功能破坏和DNA分子断裂[32,38]。
为避免冷冻过程中的精子损伤，冷冻保护剂主要为蛋黄、甘油等。蛋黄中含有精子低密度脂蛋白、磷脂、胆固醇、营养物等，不仅可以起到维持精子活力的作用，还能通过将胆固醇、磷脂等转移到精子膜上，调节精子膜流动性和渗透性。同时它与甘油一起增加了冷冻保护剂的浓稠度，有利于降低大颗粒冰晶的形成[39]。甘油在细胞、精子的冷冻保存中都是必不可少的低温保存保护剂，可以通过改变细胞渗透压、降低水分子的比例抑制冰晶形成，从而减少因降温形成冰晶对细胞的破坏[31-32,40]。研究发现以高渗透（400 mOsm/kg）性和低甘油比例（最终浓度2%）的冷冻保护剂更有利于猪精子的低温保存[41]。
3.3 精子的分装
不同的精子分装规格也会影响精液冷冻的效果。精子冷冻保存分装规格主要有5mL、1mL、0.5mL和0.25mL细管[42]，小体积分装冷冻时因为冷冻表面积的增大，冷冻和解冻过程可能受冷或热更加均匀，从而获得更好的冷冻效果[28]。
4 复温过程的损伤机制与保护策略
解冻过程中，由于精子膜内外的融化速度不一致，一方面容易再次形成大颗粒冰晶，破坏精子膜和线粒体造成结构与功能的损伤，另一方面也可能导致精子膜两侧渗透性差异造成细胞肿胀与破裂，因此，解冻温度与速率直接影响超低温保存精子的质量[30,36]。
因此，精液的解冻复温也是冷冻精液应用于生产的关键，目前猪的冷冻精液解冻多用快速解冻法。将精液从液氮罐取出后迅速放入50℃水浴解冻15～20s，取出放入38℃环境下，也有学者用37℃水浴中解冻30～45s的方法完成解冻复苏[20]。精液解冻后以1∶20的体积稀释或依据冷冻时精子浓度稀释至2×107个/mL，经镜检合格再进行人工输精[7,42-43]。解冻液需满足精子生存所需的渗透压和pH值，足够的能量物质即葡萄糖、果糖以及酸、碱、盐等。目前在精子冷冻与解冻过程用于稀释、维持精子活力的溶液主要有贝滋维尔溶液[5,35]、莫德纳溶液[41]、莫德纳溶液B[44]。
5 总结
猪精液超低温冷冻保存技术以减少精子氧化损伤、调节精子结构与功能状态等方向为目标不断发展。围绕精子冷冻和解冻各环节中的损伤机制不断破解，保护策略也愈加完善。高质量猪冷冻精液的生产和应用对优质种质资源的保存和利用具有重要意义。
