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豆粕是大豆加工副产品，富含多种营养物质，其中蛋白质含量为40%—50%，脂肪为1%—2%，碳水化合物约为10%—15%，且较鱼粉价格低，是目前最广泛使用的植物性蛋白质饲料原料。但豆粕中存在多种抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子、抗原蛋白、寡糖等，会造成畜禽生产性能和饲料利用率降低。目前消除豆粕中抗营养因子的主要方法包括物理法、化学法、微生物发酵法及添加酶制剂法，其中微生物发酵法安全、健康、高效，可最大限度地降解豆粕中的抗营养因子，并产生乳酸、维生素、益生菌等活性物质。然而由于发酵菌种、发酵工艺及豆粕本身特性的差异，目前市场上发酵豆粕产品质量良莠不齐。基于此，有必要对现行市场上流通的豆粕和发酵豆粕中的抗营养因子水平进行调查分析，为其在饲料中的合理使用提供数据依据。
【前人研究进展】目前研究发现发酵可明显降低豆粕中胰蛋白酶抑制因子、植酸、大豆凝集素、寡糖、抗原蛋白、脲酶的含量。Hirabayashi 等使用宇佐美曲霉发酵豆粕，发现发酵后豆粕中的植酸全部被降解。Feng 等使用产蛋白酶菌—米曲霉发酵豆粕，可完全消除豆粕中胰蛋白酶抑制因子。此外发酵还可以提高粗蛋白质、氨基酸、多种活性物质的含量，同时产生特殊气味，提高动物适口性。
【本研究切入点】本研究分析了6 种对动物健康和发育有较大影响的抗营养因子，包括热不稳定性的胰蛋白酶抑制因子、脲酶和热稳定性大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、棉籽糖以及水苏糖。其中脲酶活性是评价豆粕营养价值的主要指标；胰蛋白酶抑制因子受其分析方法的限制少有人检测，往往是通过脲酶活性对其进行间接评价。本研究发现脲酶含量并不能客观反映胰蛋白酶抑制因子的变化。棉籽糖和水苏糖占低聚糖总量的90%，具有热稳定性，加热不能使其失活，同时不同的发酵工艺对两种低聚糖的消除情况也不尽相同；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白是两种主要的抗原蛋白，不能通过简单的加热使其钝化。因此有必要对市场流通的豆粕及发酵豆粕中上述6 种抗营养因子的含量水平进行调查分析。
【拟解决的关键问题】采用HPLC 测定棉籽糖和水苏糖含量，应用ELISA 法对β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子的含量进行测定，而脲酶采用国标方法进行测定。比较豆粕与发酵豆粕中主要抗营养因子含量，总结二者中抗营养因子含量的正常值范围，对当前市场上的豆粕及发酵豆粕质量进行分析。
1、材料与方法
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪、高速离心机、涡旋仪、旋转蒸发仪、酸度计、水浴锅、酶标仪。大豆胰蛋白酶抑制因子定量检测试剂盒、大豆球蛋白定量检测试剂盒、β-伴大豆球蛋白定量检测试剂盒。棉籽糖和水苏糖标准品（纯度99.5%），乙醇水溶液（浓度为70%），试验用水为Millipore 纯水系统制得的高纯水，乙腈为HPLC 纯；尿素缓冲液pH 7.0±0.1（称取8.95 g 磷酸氢二钠，3.4 g 磷酸二氢钾溶于水，再将30 g 尿素溶在此缓冲液中）、盐酸溶液C（HCl）=0.1 mol·L-（1 称取8.3 mL盐酸用水稀释至1 000 mL）、氢氧化钠标准溶液C（NaOH）=0.1 mol·L-1（称取4 gNaOH 用水稀释至1 000 mL）。
1.2 样品来源
样品来源：山东、河南、天津、北京、辽宁、黑龙江、河北、江苏、浙江、重庆10 个省（市、自治区）经营和使用环节的65 批次豆粕；山东、河南、广东、北京、浙江、江西、江苏、湖北、上海、天津、辽宁、四川、福建13 个省（市、自治区）经营和使用环节的54 批次发酵豆粕。取样地区和数量见表1。
1.3 样品测定方法
1.3.1 棉籽糖和水苏糖的测定
参考文献并进行单因素试验，对提取方法、料液比、提取液浓度进行优化，最终确定试验方案。该试验的优化及试验方案另文撰写。
1.3.2 脲酶的测定
参照GB/T8622-2006《饲料用大豆制品中脲酶活性的测定》测定豆粕和发酵豆粕中的脲酶。
1.3.3 大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，胰蛋白酶抑制因子的测定
ELISA 测定过程参照产品说明书进行。具体过程如下：称取一定质量样品（抗原蛋白0.300 g，胰蛋白酶抑制因子0.100 g，均精确到0.001 g）于50 mL 离心管中，加入30 mL 提取液，于25℃振荡16 h，静置2 min 后，离心5 min（4 000 r/min），取上清液并稀释70 倍。将样品盒标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准液平行测定两次，记录校准孔和样品孔所在的位置，经过加样、洗板、加酶标试剂、显色，加终止液后于450/630 nm 双波下读取吸光度值。按照下列公式计算吸光率：百分吸光率(%)=B/B0×100%其中，B 为校准品或样品的平均吸光度值，B0 是标准品1 的平均吸光度值。校准曲线的绘制：以校准品百分吸光率为纵坐标，以校准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。
1.4 数据分析
试验数据采用Excel 2012 进行统计并采用百分位数法进行分析。
2、结果
2.1 豆粕和发酵豆粕中大豆球蛋白的含量分析
利用ELISA 试剂盒分析豆粕和发酵豆粕中大豆球蛋白，结果见表2。发酵豆粕中大豆球蛋白平均含量比豆粕减少57.7%。从图1-a 可明显看出，90%的豆粕中大豆球蛋白含量聚集在60—180 mg·g-1 范围内，而90%的发酵豆粕中的大豆球蛋白含量主要集中在0—120 mg·g-1。采用百分位数法对数据进行分析，得出豆粕P90（90%的检测值小于P90）是177.3 mg·g-1，发酵豆粕中大豆球蛋白含量的百分位数值P90 是109.4mg·g-1。可以推断出豆粕中的大豆球蛋白含量正常值范围在58.9—P90（177.3 mg·g-1）之间，发酵豆粕中大豆球蛋白含量正常值范围为ND—P90（109.4 mg·g-1）。
2.2 豆粕和发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的含量分析
结合表2 发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白平均含量相较于豆粕降低了63.2%。图1-b 揭示了豆粕和发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量聚集范围及变化趋势，所调查的65 批次豆粕中β-伴大豆球蛋白含量主要集中在42.8—150 mg·g-1范围内，含量百分比约85%，而54批次的发酵豆粕中的β-伴大豆球蛋白含量主要聚集在0—60 mg·g-1 范围内，所占百分比为83%。采用百分位数法对数据进行统计分析，得出豆粕中β-伴大豆球蛋白百分位数值P85 是147.2 mg·g-1，而发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白百分位数值P85 是53.8 mg·g-1，由这些数据可以判断豆粕及发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白含量正常值范围分别为42.8—P85（147.2 mg·g-1）和ND—P85（61.8 mg·g-1）。
2.3 豆粕和发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的含量分析
胰蛋白抑制因子平均含量在发酵豆粕中比在豆粕中降低了59.1%（表2），此结果与陈斌在微生物发酵对豆粕中抗营养因子及营养价值的影响中的胰蛋白酶抑制因子下降了50.4%的结果相近。从图1-c 中可以看出发酵豆粕和豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量变化趋势及主要集中范围，二者均较低且主要分布在0—40 mg·g-1 范围内，但发酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子比豆粕中的胰蛋白酶抑制因子低，其中80%的发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量在0—10 mg·g-1，而80%豆粕胰蛋白酶抑制因子的含量主要聚集在0—30mg·g-1，豆粕中胰蛋白酶抑制因子P80 为28.6 mg·g-1，发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子P80 为9.9 mg·g-1，采用百分位数法分析进一步表明发酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子含量降低，豆粕及发酵豆粕胰蛋白抑制因子含量正常值范围应为ND—P80（28.6 mg·g-1）、ND—P80（9.9 mg·g-1）。
2.4 豆粕和发酵豆粕中低聚糖的含量分析
液相色谱检测低聚糖方法最小检出限为0.01mg·g-1，发酵豆粕中棉籽糖平均含量比豆粕减少了82.5%、水苏糖平均含量降低了82.5%（表2）。从图1-d 中可以看出90%的发酵豆粕中棉籽糖含量在0—6mg·g-1 范围内，而90%豆粕中棉籽糖的含量在6—15mg·g-1 范围内。86%的豆粕中水苏糖含量在21—42mg·g-1 范围内，而87%的发酵豆粕中水苏糖含量在0—14 mg·g-1 范围内。采用百分位数法对这一结果进行分析，豆粕中的棉籽糖含量P90 为13.79 mg·g-1，而棉籽糖在发酵豆粕的含量P90为4.65 mg·g-1 。豆粕P85中的水苏糖含量为33.29 mg·g-1，发酵豆粕中水苏糖含量P85 为11.58 mg·g-1，以上数据充分说明了发酵豆粕中
图1 豆粕及发酵豆粕中抗营养因子含量百分比（大豆球蛋白：a；β-伴大豆球蛋白：b；胰蛋白酶抑制因子：c；棉籽糖：d；水苏糖：e）低聚糖含量普遍低于豆粕。豆粕和发酵豆粕中棉籽糖含量正常值范围为ND—P90（13.79 mg·g-1）、ND—P90（4.65 mg·g-1），水苏糖的含量正常值范围为ND—P85（33.29 mg·g-1）、ND—P85（11.58 mg·g-1）。
2.5 豆粕和发酵豆粕中脲酶的活性分析
采用百分位数法对数据进行统计分析，得出豆粕中脲酶百分位数值P90是0.19 U·g-1，P97 是0.40 U·g-1，符合国家标准规定的饲用豆粕的脲酶含量为0.02—0.45 U·g-1，由这些数据可以判定，豆粕中脲酶含量正常值范围应在ND—P97（0.40 U·g-1）之间。发酵豆粕中的脲酶未检出，结果表明发酵可以显著降低脲酶活性。
3、讨 论
本次调查抽取的65 批次豆粕和54 批次发酵豆粕经检测分析表明发酵豆粕所含的不同种类的抗营养因子的量比豆粕低，但不乏部分发酵豆粕中抗营养因子含量居高的现象，可能是加工程度、发酵工艺、大豆品种的问题。
3.1 与现有报道中抗营养因子的含量比较
本抽样调查的65 批次豆粕中大豆球蛋白含量正常值范围为58.9—177.3 mg·g-1，小于文献总结的豆粕中的含量400 mg·g-1，而54 批次的发酵豆粕中大豆球蛋白含量正常值范围为≤109.34 mg·g-1，超出了文献中的含量范围＜0.02 mg·g-1，说明现行市场中的发酵豆粕中大豆球蛋白含量普遍居高。豆粕中β-伴大豆球蛋白含量正常值范围是42.8—185.8 mg·g-1，89%的豆粕在≤155 mg·g-1范围内，而其在发酵豆粕中的含量正常值范围为≤61.8 mg·g-1，超过了文献中的的含量范围≤0.01 mg·g-1。胰蛋白酶抑制因子含量正常值范围为≤28.6 mg·g-1，与胰蛋白酶抑制因子在豆粕中的含量为2%左右一致。豆粕中棉籽糖含量正常值范围为≤13.79 mg·g-1，接近1%，豆粕中水苏糖含量正常值范围≤33.29 mg·g-1 与文献报道基本一致，发酵豆粕的棉籽糖含量正常值范围为≤4.65 mg·g-1，发酵豆粕中水苏糖含量正常值范围为≤11.58 mg·g-1，合计为≤16.23 mg·g-1，与现有报道中＜0.9%有一定的出入。豆粕中脲酶活性范围≤0.40 U·g-1，发酵之后脲酶活性未检出，则说明发酵之后脲酶完全降解，该结果与现有研究中关于黑曲霉发酵豆粕中脲酶全部被降解的结果相一致。根据研究结果，豆粕中抗营养因子含量基本与现有研究结果相符，但发酵豆粕中抗原蛋白的含量居高，表明现在的发酵工艺对胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、脲酶的钝化水平高于对抗原蛋白的消除水平。此外，不同的发酵豆粕中同种抗营养因子含量差异较大，部分产品的抗营养因子含量与豆粕相当，因此发酵工艺，豆粕质量是影响发酵后抗营养因子钝化程度的重要原因。
3.2 抗营养因子钝化情况的比较
抗营养因子在发酵过程中钝化机理不同导致其消除程度也会有差异。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量降低的程度趋于一致，分别为57.71%、63.2%、59.08%。这可能是由于豆粕中的蛋白质经微生物发酵分解，使抗原蛋白和胰蛋白酶抑制因子含量下降。
3.3 抗营养因子之间的含量比较
研究结果发现，在豆粕和发酵豆粕中，6 种抗营养因子含量排序均为大豆球蛋白＞β-伴大豆球蛋白＞胰蛋白酶抑制因子＞水苏糖＞棉籽糖＞脲酶，与现有研究报道相一致。有研究表明，仔猪肠道对日粮抗原过敏，从而导致肠道损伤，是仔猪断奶后腹泻和生长发育受阻的一项主要原因。胰蛋白酶抑制因子的抗营养作用主要表现在抑制动物生长，降低胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性，影响营养物质的消化，并造成胰腺肿大等方面，但目前豆粕的质量评价只通过测定脲酶活性间接反映胰蛋白酶抑制因子的含量，但脲酶活性是豆粕中起最低抗营养作用的因素且在发酵过程中脲酶可基本全部降解，不能准确反映胰蛋白酶抑制因子钝化情况。此外，过量的大豆寡糖，易引起动物腹鸣、腹胀、腹泻，虽然含量低于前3 个抗营养因子，但其抗营养效应显著为保证动物健康。综上，有必要对这6 种抗营养因子进行钝化并对其含量进行测定。
4、结论
本研究调查分析了市场中的65 批次豆粕和54 批次的发酵豆粕，其中主要抗营养因子进行了含量分析。结果表明，发酵豆粕中的抗营养因子含量低于豆粕，由于不同厂家使用菌种种类、菌种数目、加工工艺的不同其含量不完全相同，建议对豆粕质量评价指标中加入对动物影响较大的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子的含量分析，更全面地测定并反映豆粕及发酵豆粕的质量。同时本研究中推断出抗营养因子的含量正常值范围，有助于了解现行市场的豆粕和发酵豆粕的抗营养因子含量水平，并对饲料企业和养殖行业对豆粕及发酵豆粕的选择有指导意义。（资料来源：中国农业科学；作者：杨玉娟, 姚怡莎, 秦玉昌等）
